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            實時定量PCR實驗室管理及污染預防

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            實時定量PCR實驗室管理及污染預防

            2019/06/12 08:53
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            【摘要】:
            經常用稀酸擦拭可能污染區域或對環境進行紫外照射,可有效預防PCR實驗室環境污染。
             
            PCR(聚合酶鍊式反應)檢測技術廣泛應用于臨床和預防醫學中,特别是針對病毒的檢驗,PCR反應的特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛的問題是易污染,微量的污染即可造成假陽性的産生。
             
            為降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。應該從實驗室區域劃分做起。根據臨床基因擴增檢驗實驗室區域設置原則 :基因擴增檢驗實驗室 區域應包括①試劑儲存和準備區,②标本制備區,③擴增反應混合物配制和擴增區,④擴增産物分析區。各工作區域須有明确的标記,避免不同工作區域内的設備、物品混用。進入各工作區域嚴格按照單一方向進行,即試劑儲存和準備區→标本制備區→擴增反應混合物配制和擴增區→擴增産物分析區。不同的工作區域使用不同的工作服(例如不同的顔色)。工作人員離開各工作區域時,不得将工作服帶出。
             
            工作區域儀器設備配置也有相應的标準。每個區域均需配置基本設置包括微量加樣器(覆蓋1-1000u1),可移動紫外燈(近工作台面),消耗品:一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯),專用工作服和工作鞋,專用辦公用品。另外各區還需配置如下實驗用品。試劑儲存和準備區:2~8℃和-15℃冰箱,混勻器;标本膜闆制備區:2~8℃冰箱、-20或-80℃冰箱,高速台式冷凍離心機,混勻器,水浴箱或加熱模塊,超淨工作台,如需處理大分子DNA,應具有超聲波水浴儀,0.2mL和1.5mL的EP管。擴增反應混合物配制和擴增區:核酸擴增儀和實時定量核酸擴增儀;0.2mL的PCR反應管,96或384孔PCR反應闆。擴增産物分析區,視檢驗方法不同而定。
             
            工作區域按規定管理之後,還得要求操作人員進行PCR操作時嚴格遵守操作規程,以降低可能出現的PCR污染。
             
            首先要做好污染的監測,以便采取措施,防止和消除污染。監測包括設立陽性對照,陰性對照,進行重複性試驗,和選擇不同區域的引物進行PCR擴增。
             
            其中陽性對照應選擇擴增度中等、重複性好的标本,如以重組質粒為陽性對照,其含量通常要求在100個拷貝以下。實驗穩定後,可免設陽性對照。每次PCR實驗務必做陰性對照。包括:①樣本對照,僅加入樣本,②試劑對照,僅加PCR試劑,不加模闆。
             
            分裝試劑應注意:PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超淨工作台或負壓工作台配制和分裝;引物,dNTP用高壓的雙蒸水配制;配制後應分裝儲存,标明時間,以備發生污染時查找原因。
             
            PCR實驗操作中,擴增序列的殘留污染是假陽性的主要原因,樣品間的交叉污染其次。因此,在進行擴增反應需謹慎,收集樣品、抽提和擴增時也應注意:戴一次性手套,并及時更換;使用一次性吸頭,及時丢棄,且不與PCR産物分析室的吸頭混用;避免反應液飛濺,開蓋前稍離心。若濺出,應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;操作多份樣品時,制備反應混合液,先将dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然後分裝;盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,因為加樣器容易受産物氣溶膠或标本DNA的污染。加樣器不交叉使用。
             
            環境污染中常見的污染源主要有:經常用稀酸擦拭可能污染區域或對環境進行紫外照射,可有效預防PCR實驗室環境污染。也可用擦拭實驗來查找可疑污染源:用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源;0.1mL去離子水浸泡;取5μL做PCR實驗;電泳檢測結果。污染還可能足由空氣中含PCR産物的氣溶膠造成的,因此,實驗場所要保持通風良好。
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